J Virol. |泛素特异性蛋白酶1通过调节K48泛素化稳定PRRSV非结构蛋白Nsp1β促进病毒复制
河南农业大学翟云云等人于2024年发表在Journal of Virology杂志上的一篇“Ubiquitin-specific proteinase 1 stabilizes PRRSV nonstructural protein Nsp1β to promote viral replication by regulating K48 ubiquitination”。该研究揭示了PRRSV募集宿主因子USP1促进病毒复制的机制，为PRRSV防御提供了新的靶点。
结果1：ML323抑制PRRSV复制
作者评估了10种去泛素化酶抑制剂。发现ML323具有最显著的抑制作用（图1A）故选择ML323进行详细研究。但为了验证ML323的种间变异性，在不同的细胞系中进行了验证，发现人源的HEK293T、猪源的PAM-Tang和猴源的MARC-145细胞在ML323处理后表现出对USP1蛋白表达的抑制作用（图1B）。作者检测了用不同浓度（0、1、3和10µM）的ML323处理后PRRSV宿主细胞系PAM Tang中PRRSV ORF7的转录水平，结果显示ML323以浓度依赖的方式降低了PRRSV ORF7的mRNA水平（图1C）。随后，使用BJ-4和rSD16 PRRSV菌株感染细胞，并观察不同ML323剂量如何影响PRRSV复制。结果表明，ML323显著且剂量依赖性地降低了PRRSV BJ-4和rSD16 ORF7的mRNA表达（图1D）。蛋白免疫印迹分析显示，ML323可以显著降低PRRSV N蛋白的表达并抑制USP1的表达（图1E）。ML323同时使PRRSV BJ-4和rSD16病毒滴度呈剂量依赖性降低（图1F）。荧光显微镜、蛋白免疫印迹和流式细胞术（图1G和H）测定进一步证实ML323抑制rSD16复制。这些结果表明ML323抑制了PRRSV的复制。
结果2：USP1可增强PRRSV感染
为了验证USP1在PRRSV感染中的作用，作者构建了猴源的USP1-Flag表达载体，并在MARC-145细胞中进行了验证（图2A）。作者利用RT-PCR、蛋白免疫印迹和TCID50测定表明，USP1过表达促进PRRSV N蛋白表达，增加了PRRSV粒子的产量（图2B-D）。通过利用rSD16，进一步验证了USP1表达的影响，并在荧光显微镜、蛋白免疫印迹和流式细胞术中显示（图2E和F）。根据这些发现，USP1可能会促进PRRSV的复制。
结果3：敲除USP1抑制PRRSV复制
作者创建了三个小干扰RNA来阻断USP1在MARC-145细胞中的表达，以证实USP1在PRRSV感染中的功能。结果显示，所有小干扰RNA都可以降低USP1蛋白水平（图3A）和USP1 mRNA表达（图3B），其中USP1 RNAi#3表现出最高的干扰效率。USP1被干扰后，作者利用RT-PCR、蛋白免疫印迹和TCID50测定表明，PRRSV BJ-4和rSD16子代病毒粒子显著减少（图3C-E）。荧光显微镜、蛋白免疫印迹和流式细胞术显示，USP1的干扰显著抑制rSD16的复制（图3F和G）。这些结果表明USP1正调控PRRSV的增殖。为了进一步证实USP1在PRRSV复制中的调节作用，作者通过CRISPR/Cas9技术产生了USP1缺陷的MARC-145细胞，并通过蛋白免疫印迹验证了USP1在细胞中的蛋白质表达（图4A）。USP1缺失降低了USP1敲低细胞后PRRSV BJ-4 ORF7 mRNA水平和PRRSV N蛋白表达并用PRRSV感染对照细胞（图4B和C）。在USP1敲低细胞中病毒滴度显著降低（图4D）。荧光显微镜、蛋白免疫印迹和流式细胞术分析显示，在没有USP1的情况下，PRRSV感染的细胞显著减少（图4E和F）。这些结果与USP1敲低模型的结果相匹配，表明USP1有助于PRRSV的传播。
结果4：USP1与Nsp1β相互作用并使其稳定
为了阐明USP1和Nsp1β之间的关系，进一步探讨USP1在PRRSV感染中的作用机制，作者构建了PRRSV的真核表达质粒。根据蛋白免疫印迹结果显示，在USP1 KO MARC-145细胞中，PRRSV蛋白水平显著下调（图第5A段）。同时，Nsp1β的表达在ML323处理和USP1敲低后受到显著抑制（图5B和C）。用USP1质粒共转染Nsp1β的结果显示，不同剂量的USP1促进了Nsp1β蛋白的表达（图5D）。作者发现USP1和Nsp1β互作，但与其他Nsp1不相互作用（图5E和F），并且在MARC-145细胞中，USP1和Nsp1β共定位（图5G），表明USP1与Nsp1β有关。此外，Co-IP结果显示Nsp1β可以与MARC-145细胞中的内源性USP1结合（图5H）。上述结果表明，USP1与Nsp1β结合，并且USP1稳定PRRSV非结构蛋白Nsp1β。
结果5：USP1通过在45位切割Nsp1β赖氨酸上的K48泛素化来稳定Nsp1β蛋白
由于USP1具有去泛素酶的功能，作者接下来验证了USP1对Nsp1β蛋白稳定性的影响。K48泛素化修饰被认为是蛋白酶体途径降解的主要信号。作者发现Nsp1β主要经历K48连接的泛素化修饰（图6A）。USP1通过裂解Nsp1β的K48泛素化修饰来稳定Nsp1β蛋白（图6B-C）。作者定位了Nsp1β的结构域，并构建了相应的截短体，其由氨基酸（aa）1至111（Nsp1β-NL-Flag）和氨基酸112至229（Nsp1α-PC-Flag）组成（图第7A段）。Co-IP结果显示，K48泛素化修饰主要在Nsp1β-NL处形成，而Nsp1β-PC突变体没有明显的泛素化修改（图7B和C）。进一步的结果表明，与Nsp1β-PC相比，野生型Nsp1β和Nsp1β-NL突变体都具有显著的K48泛素化（图第7D段）。根据上述结果，将Nsp1β泛素化位点集中在1-111结构域中。随后，为了鉴定Nsp1β的泛素化位点，构建了Nsp1β-NL突变体（K16R、K45R、K57R和K86R）。Co-IP结果显示，Nsp1β-NL K45R突变体没有形成泛素化，表明K45可能是Nsp1β的泛素化位点（图第7E段）。进一步构建了Nsp1βK45R突变体，结果表明，在Nsp1β的45赖氨酸沉默后，Nsp1β不进行K48泛素化（图第7F段）。这些结果表明，USP1通过消除45位赖氨酸的K48泛素化来稳定Nsp1β蛋白。
结果6：USP1不促进PRRSV rSD16-K45R的复制
作者研究了Nsp1β的K48泛素化对病毒复制的影响。构建了PRRSV rSD16-K45R突变病毒，并将该突变病毒与野生型病毒进行了比较。作者通过TCID50和蛋白免疫印迹（图8A和B），发现rSD16-K45R病毒能够在体外稳定复制。作者研究了USP1如何影响rSD16-K45R病毒的传播。使用WT病毒作为对照，rSD16-K45R N蛋白表达不随USP1表达而改变（图8C）。在ML323上处理后，内源性USP1蛋白水平降低，但rSD16-K45R N蛋白没有改变，并使用WT病毒作为对照（图8D）。rSD16-K45R N蛋白在敲除或敲除USP1后没有降解（图8E和F）。这些结果表明，Nsp1β45位的赖氨酸对病毒复制至关重要，rSD16-K45R病毒更稳定。
原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10949481/pdf/jvi.01686-23.pdf